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a process used for separating mixtures by virtue of differences in absorbency

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色層分析法(混合物を成分に分離する方法)

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出典(authority):フリー百科事典『ウィキペディア（Wikipedia）』「2014/03/01 10:40:39」(JST)

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クロロフィルはクロマトグラフィーによって成分ごとに分離することができる。

クロマトグラフィー (Chromatography) はロシアの植物学者ミハイル・ツヴェットが発明した、物質を分離・精製する技法。物質の大きさ・吸着力・電荷・質量・疎水性などの違いを利用して、物質を成分ごとに分離する。クロマトグラフィーは色（ギリシャ語で chrōma）を分けるといった意味合いを持つ。これは、ツヴェットがクロマトグラフィーで植物色素を分離した際に色素別に色が分かれて帯ができたことに由来する。

クロマトグラフィーは、固定相または担体と呼ばれる物質の表面あるいは内部を、移動相と呼ばれる物質が通過する過程で物質が分離されていく。固定相には固体または液体が用いられ、液体のものはLC (Liquid Chromatography)、固体のものはSC (Solid Chromatography) と呼ばれる。移動相には気体、液体、超臨界流体の三種類が存在し、順に、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィーと呼ぶ。

原理[編集]

クロマトグラフィー分離の物理化学的原理は、分配、吸着、分子排斥、イオン交換が挙げられる。種々のクロマトグラフィー担体が存在するが、これらの分離原理を単独で示すものはなく、多かれ少なかれこれらの分離作用を併せ持つ。したがって、複数のうち、最も特徴的な分離作用をもってクロマトグラフィーの種類・区分とすることが普通である。またアフィニティークロマトグラフィーは分子生物学的反応である抗原抗体反応あるいは酵素または受容体の基質特異性を分離に用いている。

分配クロマトグラフィー[編集]

薄層クロマトグラフィー

もっともポピュラーなクロマトグラフィーである。ガスクロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーのいずれでも利用されている。逆相薄層クロマトグラフィーや、セルロースが担体の順相薄層クロマトグラフィーとペーパークロマトグラフィーは分配クロマトグラフィーの一種。セルロースが担体の場合、セルロース上のOH基に水素結合した水が固定相となる。試料は固定相と移動相の間で連続的に分配されるため分配係数の大きなものから流出し、原理的には流出量の保持時間分布（試料ピーク）の形状はガウス分布に従う。

液体クロマトグラフィー担体としては、シリカゲル担体が知られている。このシリカゲルはシリカ (SiO₂) 表面が >Si=O ではなく >Si(OH)₂ の形をとるように化学処理を施している。したがって、通常の抽出操作に対比させると、水層がシリカゲル表面、有機層が移動相に相当し、固定相と移動相の間で分配(連続抽出)が行われる。シリカゲルでこの固定相と移動相の組み合わせを順相クロマトグラフィーと呼ぶ。

順相シリカゲルを種々の長鎖アルキルクロロシランで処理すると、Si−OH がアルキルシランで化学修飾され、固定相表面は長鎖アルキル基で覆い尽くされる。移動相に水溶媒を用いた上で前述の化学修飾シリカゲルを用いると、固定相と移動相の関係が逆転する。このような固定相と移動相の組み合わせを逆相クロマトグラフィーと呼ぶ。逆相クロマトグラフィーではおおむね極性の高い、あるいは疎水性の低い物質が先に移動する。

吸着クロマトグラフィー[編集]

ガスクロマトグラフ

固定相表面と試料との吸着力の差により分離されるクロマトグラフィーである。

溶媒が存在すると試料が溶媒和されて吸着現象が現れにくくなるので、分離能が要求される分析クロマトグラフィーではもっぱらガスクロマトグラフィーで利用される。

分取クロマトグラフィーでは逆相条件で、（イオン交換基を持たない）レジンにサンプルを吸着させて精製する技法がある（通常は別の手段で分離できるので、よほど不安定な試料の際に用いられる。当然分離能は悪い）。

分子排斥クロマトグラフィー[編集]

サイズ排除クロマトグラフィー、分子篩（ふるい）クロマトグラフィー、SEC (Size Exclusion Chromatography) とも呼ばれる。試料の分子サイズに基づく篩い分けを原理とするクロマトグラフィーである。移動相が有機溶媒であるゲル浸透クロマトグラフィー (GPC, Gel Permeation Chromatography) と、移動相が水溶液であるゲル濾過クロマトグラフィー (GFC, Gel Filtration Chromatography) とに大別される。

固定相担体は表面から内部に向かって狭くなる多孔質の素材でできている。したがって、多孔質のサイズが問題になるほど巨大な分子の場合、固定相内部まで分散侵入することができない。言い換えると小分子は担体内部にまで拡散できるが、大分子は担体の外部を流れ去るだけである。

このように試料のサイズにより見かけの固定相容積が異なるので、巨大分子が先に、小分子が後に流出してくる。この原理を分子排斥クロマトグラフィーと呼ぶ。用途としては合成高分子、天然高分子の分子量、オリゴマーの分離などに用いられている。

特徴として

高分子物質の各種平均分子量及び分子量分布が同時に測定できる。
測定可能な分子量範囲が、数百～数千万と広い。

などが挙げられ、注意点としては、

分子量と、実際の分子の大きさとは必ずしも一致しない。
試料成分と充填剤に相互作用(吸着、イオン交換など)があると正しい分子量を測定できない。

などである。

分子排斥クロマトグラフィーはデキストリンゲルやアガロースゲルを使用した酵素たんぱく質の精製法として開発され、生化学、分子生物学の分野で利用されている。

イオン交換クロマトグラフィー[編集]

イオン交換樹脂を固定相に対してイオン性の試料を施すと、分子種と固定相との酸塩基の平衡定数の大小にしたがって連続的に分配されることになる。この原理に従うクロマトグラフィーをイオンクロマトグラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフィーと呼ぶ。

クロマトグラム[編集]

クロマトグラム

クロマトグラフィーを適用した結果は各成分ピークの移動速度として現れるが、それを特定時間における移動距離としてあらわしたり、カラム末端から時系列に現れる様をチャートに表したものをクロマトグラム (Chromatogram) と呼ぶ。すなわち、薄層クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーでは移動速度の比を R_f 値としてあらわし、HPLCあるいはガスクロマトグラフィーにおいては時間軸に対する検出器応答をプロットしたものでのピークの出現時間を保持時間と呼んであらわす。また検出器で定量的に検出する場合は、ピーク面積から相対量を決定することができるので、クロマトグラフィーで分離された各成分の同定・定量をおこなうことが可能になる。また、理論段数の決定にも用いられる。

保持時間 (Retention Time) とは、サンプル注入時点から、分離された成分がピークを示す時点までの時間をいう。保持時間は分析条件が等しいかぎり物質によって固有の値であるため、これを用いて試料の同定を行うことができる。ただし、予め既知試料を用いてサンプルに含まれると思われる成分の保持時間を測定しておく必要がある。

ピーク面積 (Peak Area) とは、各成分ピークとベースラインとの間の面積のことである。たいていの検出器では、ピーク面積は成分量にほぼ比例するので、予め濃度既知の試料を用いて検量線を作成することで、面積から目的成分の定量を行うことができる。

以上の分析は目的成分のピークが鋭く、かつ他成分と十分に分離していることで簡便に行えるため、良い条件が得られるように分析条件を検討するのが重要である。

分析カラムの理論段数 N の求め方は様々なものが用いられるが、通常は簡単に次式で求める。

ここで、t_R は保持時間、w_1/2 はピークの半値幅である。

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

分離の理論を段理論( plate theory )として解析するのが長い間使われてきたが、液体クロマトグラフィーに関して言うならば数学的には「線形予測」と同一で、電気理論として良く知られている「適応型フィルター」と同じである。特にリサイクルクロマトグラフィーの場合何回リサイクルすればどの程度の分離が得られるかの予想をする場合極めて便利であり、高速のコンピューターやDSPあるいは単純繰り返し計算に適したFPLAで構築すれば容易に結果を得られる。現在の所FIRとして構築した方法でしか実働させた事が無いが、サンプルインジェクションをユニットインパルス入力として取り扱えばIIRとしても構築可能である。

ガスクロマトグラフィーの場合は移動相の体積がカラムの中で徐々に増大するので「線形」では無く別な理論の取り扱いが必要となる。

また比較的新しい permiation theory と言う確率論を使ってもクロマトグラフィー分離の理論的説明が可能であるが、今の所実用化していない。^[要出典]

UpToDate Contents

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1. Testing for drugs of abuse (DOA)
2. 異常ヘモグロビン症の検査室診断 laboratory diagnosis of the hemoglobinopathies
3. 内因性および外因性ステロイドの尿中排泄の測定 measurement of urinary excretion of endogenous and exogenous glucocorticoids
4. 成人における薬物中毒への一般的アプローチ general approach to drug poisoning in adults
5. 血清および唾液中のコルチゾールの測定 measurement of cortisol in serum and saliva

Japanese Journal

水質モニタリングのためのイオンクロマトグラフィーの研究開発動向と展望(3)アミン類のイオン排除型イオンクロマトグラフィーの分離科学と応用

工業用水 = Journal of industrial water (636), 47-60, 2016-05
NAID 40020847079

Industrial Info. 抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー担体の開発

細胞 48(4), 182-186, 2016-04
NAID 40020848082

食品膜・分離技術の特注と利用 : カートリッジフィルター・クロマトグラフィー・濃縮 (第27回 MRC秋季研究例会講演概要)

MRC news (55), 10-34, 2016-04
NAID 40020846433

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Japan Pharmaceutical Reference

薬効分類名

ウイルスワクチン類

販売名

エンセバック皮下注用

組成

製法の概要

　本剤は、日本脳炎ウイルス(北京株) をVero細胞(アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞) で増殖させ、得られたウイルスをホルマリンで不活化後、しょ糖密度勾配遠心及びクロマトグラフィーで精製し、安定剤を加え充填した後、凍結乾燥したものである。
　なお、本剤は製造工程で、ウシの血液由来成分（血清）、ブタの膵臓由来成分（トリプシン）及びヒツジの毛由来成分（コレステロール）を使用している。

組成

　本剤を添付の溶剤（日本薬局方注射用水）0.7mLで溶解した時、液剤0.5mL中に次の成分を含有する。

有効成分
不活化日本脳炎ウイルス（北京株）

参照品（力価）と同等以上

添加物
塩化ナトリウム

2.73mg

添加物
リン酸水素ナトリウム水和物

1.56mg

添加物
リン酸二水素ナトリウム

0.10mg

添加物
ポリソルベート80

0.025mg

添加物
グリシン

1.0mg

添加物
乳糖水和物

25mg
　乳糖水和物はウシの乳由来成分である。

禁忌

（予防接種を受けることが適当でない者）

　被接種者が次のいずれかに該当すると認められる場合には、接種を行ってはならない。
明らかな発熱を呈している者
重篤な急性疾患にかかっていることが明らかな者
本剤の成分によってアナフィラキシーを呈したことがあることが明らかな者
上記に掲げる者のほか、予防接種を行うことが不適当な状態にある者

効能または効果

　本剤は、日本脳炎の予防に使用する。

　本剤を添付の溶剤（日本薬局方注射用水）0.7mLで溶解する。
◎初回免疫：通常、0.5mLずつを２回、１〜４週間の間隔で皮下に注射する。ただし、３歳未満の者には、0.25mLずつを同様の用法で注射する。
◎追加免疫：通常、初回免疫後おおむね１年を経過した時期に、0.5mLを１回皮下に注射する。ただし、３歳未満の者には、0.25mLを同様の用法で注射する。

基礎免疫、追加免疫及び免疫の保持

　初回免疫として２回接種を行い、さらに第１回の追加免疫を行うことにより基礎免疫ができる。その後の追加免疫のときの接種量は第１回目の追加免疫に準ずることとし、接種間隔は地域における日本脳炎ウイルスの汚染状況などに応じて実施すること。

定期接種対象者と標準的接種年齢

本剤の第１期は、生後６月から90月に至るまでの間に行う。初回免疫は３歳に達した時から４歳に達するまでの期間、追加免疫は４歳に達した時から５歳に達するまでの期間を標準的な接種年齢とする。
第２期の予防接種は、９歳以上13歳未満の者に行う。９歳に達した時から10歳に達するまでの期間を標準的な接種年齢とする。
平成７年４月２日生まれから平成19年４月１日生まれの者のうち、７歳６カ月以上９歳未満の者及び13歳以上20歳未満の者についても定期の予防接種の対象とする。

なお、本剤の定期の予防接種への使用については、予防接種実施規則によること。

他のワクチン製剤との接種間隔

　生ワクチンの接種を受けた者は、通常、27日以上、また、他の不活化ワクチンの接種を受けた者は、通常、６日以上間隔を置いて本剤を接種すること。
　ただし、医師が必要と認めた場合には、同時に接種することができる（なお、本剤を他のワクチンと混合して接種してはならない）。

慎重投与

（接種の判断を行うに際し、注意を要する者）

　被接種者が次のいずれかに該当すると認められる場合は、健康状態及び体質を勘案し、診察及び接種適否の判断を慎重に行い、予防接種の必要性、副反応、有用性について十分な説明を行い、同意を確実に得た上で、注意して接種すること。
心臓血管系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、血液疾患、発育障害等の基礎疾患を有する者
予防接種で接種後２日以内に発熱のみられた者及び全身性発疹等のアレルギーを疑う症状を呈したことがある者
過去にけいれんの既往のある者
過去に免疫不全の診断がなされている者及び近親者に先天性免疫不全症の者がいる者
本剤の成分に対してアレルギーを呈するおそれのある者

重大な副作用

ショック、アナフィラキシー（0.1％未満）：ショック、アナフィラキシー（蕁麻疹、呼吸困難、血管浮腫等）があらわれることがあるので、接種後は観察を十分に行い、異常が認められた場合には適切な処置を行うこと。
急性散在性脳脊髄炎（0.1％未満）：急性散在性脳脊髄炎（ADEM）があらわれることがある^２）３）。通常、接種後数日から２週間以内に発熱、頭痛、けいれん、運動障害、意識障害等があらわれる。本症が疑われる場合には、MRI等で診断し、適切な処置を行うこと。
脳炎・脳症（頻度不明）：脳炎・脳症があらわれることがある。接種後、発熱、四肢麻痺、けいれん、意識障害等の症状があらわれる。本症が疑われる場合には、MRI等で診断し、適切な処置を行うこと。
けいれん（頻度不明）：けいれんがあらわれることがある。通常、接種直後から数日ごろまでにけいれん症状があらわれる。本症が疑われる場合には、観察を十分に行い、適切な処置を行うこと。
血小板減少性紫斑病（頻度不明）：血小板減少性紫斑病があらわれることがある。通常、接種後数日から３週ごろに紫斑、鼻出血、口腔粘膜出血等があらわれる。本症が疑われる場合には、血液検査等を実施し、適切な処置を行うこと。

薬効薬理

　日本脳炎ウイルスは、コガタアカイエカの吸血により感染する。本ウイルスは局所のリンパ組織で増殖した後ウイルス血症を起こし、血液・脳関門を通って中枢神経系に運ばれると、日本脳炎を発症すると考えられている。あらかじめ本剤の接種により、日本脳炎ウイルスに対する能動免疫、特に中和抗体による液性免疫が獲得されていると、感染したウイルスの増殖は抑制され、発症は阻止される。
参考）受動免疫をしたマウスへの感染実験では、１：10の血中抗体価があれば、10⁵MLD₅₀（50％マウス致死量）のウイルス感染を防ぐというデータがある。１回の蚊の吸血によって注入されるウイルス量は10³〜10⁴MLD₅₀である。このような成績から１：10の抗体価があれば自然感染を防ぐと考えられている^4）。

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